进出口保健食品中伐地那非、西地那非、他达那非的检测方法

1 范围

本标准规定了保健食品中伐地那非、西地那非、他达那非的液相色谱-质谱/质谱检测方法。

本标准适用于片剂、胶囊剂和口服液剂类保健食品中伐地那非、西地那非、他达那非的检测。

2 测定方法

2.1 方法提要

片剂、胶囊剂试样中的伐地那非、西地那非、他达那非用甲醇超声提取，提取液经稀释后过滤。口服溶液剂经直接稀释后过滤，用配有电喷雾离子源的液相色谱-质谱/质谱仪进行测定，外标法定量。

2.2 试剂和材料

所有试剂除特殊注明外，均为分析纯，水为二次蒸馏水。

2.2.1 乙腈：高效液相色谱级。

2.2.2 甲醇：高效液相色谱级。

2.2.3 冰乙酸：优级纯。

2.2.4 盐酸：优级纯。

2.2.5 0.1 mol/L盐酸+甲醇混合液(9+1，体积比)。

2.2.6 伐地那非(vardenafil, CAS号：224785-90-4，分子式：C23H32N6O4S·HCl·3H2O)标准品：纯度大于等于99.5%。

2.2.7 西地那非(Sildenafil, CAS号：139755-83-2，分子式：C22H30N6O4S)标准品：纯度大于等于99.5%。

2.2.8 他达那非(tadalafil, CAS号：171596-29-5，分子式：C22H19N3O4)标准品：纯度大于等于99.5%。

2.2.9 标准溶液：分别准确称取适量伐地那非、西地那非、他达那非标准品，用甲醇配制成浓度为10 ug/mL的混合标准储备液，于4℃下保存。根据需要用0.1mol/L盐酸+甲醇混合液(2.2.5)将标准储备液稀释成1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的混合标准工作溶液。

2.3 仪器和设备

2.3.1 高效液相色谱-质谱/质谱仪：三重四极杆质谱检测器，配电喷雾离子源(ESI)。

2.3.2 超声波清洗器。

2.3.3 旋涡混匀器。

2.3.4 电子天平：感量1 mg。

2.3.5 研钵。

2.4 测定步骤

2.4.1 试样的制备

2.4.1.1 片剂

随机取同一批号的供试品20片，研细为试样。

2.4.1.2 硬胶囊

随机取同一批号的供试品20粒，倾出所有内容物，研细为试样。

2.4.1.3 软胶囊

随机取同一批号的供试品20粒，将内容物全部挤到一离心管中，充分混匀后，作为试样。

2.4.1.4 口服溶液剂

随机抽取同一批号的供试品10支(瓶)，取等量体积样品到同一容器中混匀，作为试样。

2.4.2 提取

2.4.2.1 片剂、硬胶囊、软胶囊试样

称取1 g试样(精确到0.01g)于100 ml、容量瓶中，加入90 mL甲醇，盖上盖混匀，置于超声波清洗器中超声1h，冷却至室温后用甲醇定容至刻度，混匀。取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸+甲醇混合液(2.2.5)定容后混匀，溶液过0.45 um微孔滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

2.4.2.2 口服溶液剂

准确移取1.0 mL试样于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸+甲醇混合液(2.2.5)定容，混匀，溶液过0.45um微孔滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

2.4.3 测定

2.4.3.1 液相色谱-质谱/质谱条件

a)色谱柱：柱填料为十八烷基硅烷键合相的色谱柱，2.1×150 mm, 5 um或相当者;

b)流动相：梯度洗脱程序见表1;

c)流速：0.20 mL/min;

d)柱温：40℃;

e)进样量：10 uL;

f)离子源：电喷雾离子源;

g)扫描方式：正离子;

h)检测方式：多反应监测(MRM) ;

i)雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气等气体使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求;

j)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度;

k)监测离子对(m/z)：他达那非390.4/268.3(定量离子对)、390.4/135.1、390.4/169.1;西地那非475.3/100.1(定量离子对)、475.3/58.0、475.3/311.4;伐地那非489.5/151.1(定量离子对)498.5/72.1、489.5/312.1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.4.3.2 液相色谱-质谱/质谱测定

按照2.4.3.1液相色谱-质谱/质谱条件测定样液和标准工作溶液，标准曲线法测定样液中的伐地那非、西地那非、他达那非含量。样液中被测物的响应值应在仪器线性范围之内，如果超出仪器线性范围，应用0.1mol/L，盐酸+甲醇混合液(2.2.5)进行适当稀释。在上述色谱条件下，伐地那非、西地那非、他达那非的质量色谱峰保留时间约为10.5 min、10.7 min、12.4 min。

在相同的实验条件下，样液中被测物的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，并且在扣除背景后的样品色谱图中，所选择的离子对均出现，各定性离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液的离子相对丰度一致，误差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差

2.4.3.3 空白试验

除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

2.5 结果计算和表述

用液相色谱-质谱/质谱数据处理机或按照式(1)计算样品中伐地那非、西地那非、他达那非含量，计算结果需扣除空白。

式中：

X—试样中伐地那非、西地那非、他达那非的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)或者毫克每升(mg/L);

A—样液中伐地那非、西地那非、他达那非的峰面积或峰高;

cs—标准工作液中伐地那非、西地那非、他达那非的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL);

As—标准工作液中伐地那非、西地那非、他达那非的峰面积或峰高;

V—样液最终定容体积，单位为毫升(mL) ;

Ac—空白实验液中伐地那非、西地那非、他达那非的峰面积或峰高;

m—最终样液所代表的试样质量，单位为克(g)或者所代表的试样体积单位为毫升(mL)。

3 测定低限、回收率

3.1 测定低限

本方法片剂、胶囊剂样品中伐地那非、西地那非、他达那非的测定低限均为1.0 mg/kg;测定口服溶液剂样品中伐地那非、西地那非、他达那非的测定低限均为0.010mg/L。

3.2 回收率

3.2.1 保健食品中伐地那非添加浓度及其回收率数据

片剂、胶囊剂添加浓度在1.0 mg/kg～10 mg/kg时，回收率在89.3%～104%之间。

口服溶液添加浓度在0.010 mg/L～0.10 mg/L时，回收率在94.5%～114%之间。

3.2.2 保健食品中西地那非添加浓度及其回收率数据

片剂、胶囊剂添加浓度在1.0 mg/kg～10 mg/kg时，回收率在83.8%～101%之间。

口服溶液添加浓度在0.010 mg/L～0.10 mg/L时，回收率在85.4%～108%之间。

3.2.3 保健食品中他达那非添加浓度及其回收率数据

片剂、胶囊剂添加浓度在1.0 mg/kg～10mg/kg时，回收率在81.5%～108%之间。

口服溶液添加浓度在0.010 mg/L～0.10mg/L时，回收率在85.7%～100%之间。