天下武功，唯快不破：如何快速筛选色谱柱

「天下武功，唯快不破」，这是星爷电影《功夫》中火云邪神告诉我们的一个道理。

而对于常年奔波实验一线、兼屌丝与油腻气息于一身的科研汪，快速选择色谱柱开发出检测方法不仅可以使我们「治秃有望」，亦可成为撩取小师妹芳心的工具。

所谓知己知彼，快速选择色谱柱建立在对它深入了解的基础上，我们今天就来聊聊那个「它」。

色谱柱的结构

色谱柱由接头、螺帽、柱管、填料、垫圈及过滤片等组成，其中填料为色谱柱的核心部分，科研工作者在填料上发挥奇思妙想，开发出市面上种类繁多的色谱柱，每种色谱柱又有其独特的选择性及应用。

色谱结构

• 常用的色谱柱填料基质为硅胶，硅胶作为基质有如下优点：
• 无毒无味，化学性质稳定。
• 具有高机械强度和高的比表面积。

可利用表面健合反应来广泛满足正相、反相、离子交换和体积排阻色谱的需求。

硅胶填料通式

根据 R3 基团的不同，可将色谱柱分为不同的类型。

键合是指将固定相共价结合在载体颗粒上，键合相色谱可分为正相色谱和反相色谱。

键合方式分为单官能键合、二官能键合及三官能键合：

A：三官能团键合，键合相稳定、pH耐受范围高B：二官能团键合：增加载样量及方法稳定性C：单官能团键合：柱效高，平衡块，但稳定性相对较差

由于键合烷基的空间阻位，键合最多只能反应 50% 左右的硅羟基，超过一半的活泼硅羟基能与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾。

另外，在酸性条件下，氢离子通过未封端的 Si-OH 的间隙进攻-O-Si键，可导致填料水解。

用短链硅烷(如三甲基氯硅烷)键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种技术被称为封尾。

硅胶键合相技术改进

1、空间位阻

空间阻位

普通的色谱柱在 pH <2 时不稳定，发生水解，导致键合相流失。当我们用异丙基、二异丁基来取代甲基的话，就在键合相上形成一个保护层，这样不仅能抗水解能力(pH1-8)，还能防止分离化合物与硅羟基之间的作用，改善峰型。

Zorbax SB C18 能明显改善萘心安峰形

2、极性嵌入

在碳链上键合了极性基团，流动相在该基团处形成了水「屏蔽」层媒介，水层间接屏蔽了带负电的硅羟基与目标分离物接触可能性，减少与酸、强碱性化合物的吸附，减少了拖尾现象的产生，大大地改善了色谱峰型对称性。

极性嵌入与直链烷烃键合相比较

极性嵌入的另外一个优势是碳链键合极性了基团，表现出对极性物质有更强的选择。

极性嵌入键合相 SynerigiTM 对 Estrone 和 Estradiol 的分离

另外，极性嵌入可降低「脱水」( 疏水塌陷)危险，即使在含水量高的流动相条件下，样品也同样有稳定保留和最佳峰形。

疏水塌陷：普通的 HPLC 色谱柱在有机溶剂含量低甚至 100% 水流动相条件下，一旦流速停止，推动水溶液流动相进入硅胶孔隙的压力减小，当压力降低时，疏水的微孔表面排斥极性流动相，便会发生键合相孔隙脱水，从而导致所谓的「疏水塌陷」，对化合物的保留能力大大减弱。

疏水塌陷原理及对分析物保留的影响

留时间与填料表面积与配体有关，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱保留减少 95%，记住：几乎所有的表面积都在孔内。

3、双层表面修饰

在硅胶新增加表面层硅羟基活性更低的新硅羟基 pH5.2(普通硅羟基 pH 约为 3.5)，低表面硅羟基活性，抑制二次保留 。

双层修饰及 Venusil MP C18 对吗啡、可卡因和脱氢吗啡的分离

4、双齿键合

键合相的两个硅原子之间以 Si-O-或-CH2-CH2-等基团相连，每个硅原子含有一个长链硅烷基官能团。有效地防止了超纯硅胶载体在高 pH 时的溶解，使其在高 pH 流动相中保持了极佳的稳定性，耐受 pH 达 11.5，特别适用于分离游离的强碱性化合物。

双齿键合

5、杂化技术

普通硅胶与杂化颗粒硅胶

普通硅胶在 pH>8 的条件下很容易被水解，且仅需要 4 根 Si-OH 键被水解断裂后即有1个单元的氢氧化硅释放，导致柱效下降;而杂化硅胶需要水解 6 根 Si-OH 才可将含有亚乙基桥的硅胶单元溶出，且断裂的 Si-O-Si 有可能重新连接。

所以杂化颗粒技术硅胶有较宽的 pH 及温度耐受性。如 Waters Xbridge C18 柱 pH 耐受范围 1-12，低 pH 条件下温度上限 80 ℃，高 pH 条件下温度上限 60 ℃。

杂化颗粒色谱柱在高 pH 条件下柱寿命

6、核壳技术

核壳型(core-shell)色谱填料是由著名色谱科学家 Jack Kirkland 在 2006 年研制成功的一种新型色谱填料，是指在实心硅胶球表面高密度均匀的键合了多孔硅胶层，这种壳状颗粒具有极窄的粒径分布，在提供了足够的保留和选择时，可以同时减小轴向和纵向扩散，允许使用更短的色谱柱和较高的流速以达到快速、高分辨率分离。

此外，通过优化孔隙大小和多孔层厚度，使得目标分离物实现良好的穿透，从而最大程度地提高分离能力。

核壳填料及其扩散路径

核壳型色谱柱所产生的反压明显低于 UHPLC 色谱柱，低反压可以使仪器承受压力降低，使得在常规的液相仪上就能够实现超高效液相仪的分离效果。

核壳色谱柱与常规多孔色谱柱柱压比较

核壳型色谱柱对仪器的柱外死体积要求高、且柱容量小于全多孔色谱填料，因而并不适用于大规模的制备液相分离需求。

HPLC 作为一种分析技术在药物分析、生命科学、化学等领域有着极为广泛的应用。填料做为色谱技术的核心，一直是色谱研究中最丰富、最有活力、最富于创造性的研究方向之一。近年来，色谱填料技术呈现一大趋势，利用亚 3µm 小粒径硅胶、核壳型硅胶及 UPLC 实现复杂样品的快速高效率分离。

参考：[1]https://zhidao.baidu.com/question/449992197.html[2]http://news.ifeng.com/society/2/detail_2013_05/04/24919456_0.shtml[3]https://mp.weixin.qq.com/s/dYuDjalRHsUndqx50-_fRg[4]http://mooc.chaoxing.com/nodedetailcontroller/visitnodedetail?knowledgeId=2586280[5]http://www.258.com/product/14036796.html[6]https://wenku.baidu.com/view/4e88584fc850ad02de80412b.html?from=search[7]https://wenku.baidu.com/view/8a95918ffab069dc51220175.html?from=search[8]http://www.dxy.cn/bbs/topic/33734464[9]https://www.instrument.com.cn/news/20140609/133014.shtml[10]Phenomenex Aeris 中文手册